Microorganismos patógenos

a) Investigación de Salmonella (género) y Escherichia coli.

MATERIALES

Pipetas de 10 mL y de 1 mL

Propipetas

Placas estériles

Caldo lactosado (90 mL)

Caldo tetrationato

Caldo selenito cistina

Agar verde brillante

Agar desoxicolato

Agar sulfito bismuto

Agar triple azúcar hierro (TSI)

Agar MacConkey

Agar Levine

Asa y filamento

Mechero

Equipo para coloración de Gram

Estufa

PROCEDIMIENTO

Transferir con una pipeta estéril, 10 mL de la muestra a un balón que contiene 90mL de caldo lactosado. Incubar a 30 - 35ºC por 24 a 48 horas.

Aislamiento de Salmonella

1. Agitar la mezcla incubada y transferir 1 mL a un tubo con 10 mL de caldo selenito-cistina y 1 mL a un tubo con 10 mL de caldo tetrationato. Incubar a 35ºCpor 12 - 24 horas.

2. Después del período de incubación, mediante un asa, hacer aislamientos a par-tir de los caldos selenito-cistina y tetrationato a los agares verde brillante, desoxicolato citrato y sulfito-bismuto. Incubar a 35ºC por 24 - 48 horas.

3. Notar la presencia de colonias típicas de Salmonella:

Agar verde brillante: Pequeñas, incoloras, rosadas ó fucsias, transparentes u opacas, sobre el medio coloreado de rosado a rojo.

Agar desoxicolato- citrato: Pequeñas, incoloras, elevadas, opacas; algunas cepas producen colonias con el centro negro.

Agar sulfito-bismuto: Marrones o negras, algunas veces con brillo metálico alrededor de la colonia ( S.typhi ). Algunas cepas producen colonias verdes con poco o ningún oscurecimiento del medio.

4. Si no hay colonias típicas, la muestra cumple los requisitos en cuanto a ausencia de Salmonella .

5. Si se encuentran colonias típicas, transferir a agar nutritivo inclinado y a agar hierro tres azúcares (TSI, triple sugar iron). Incubar a 35ºC por 18 - 24 horas.

6. Los cultivos típicos de Salmonella en agar TSI presentan la parte inferior del medio amarilla (formación de ácido) y el bisel rojo (alcalino), con o sin oscurecimiento, generalmente con formación de gas.

7. Hacer una coloración de Gram: los miembros del género Salmonella, son bacilos Gram negativos no esporulados.

8. Confirmar la presencia de Salmonella por pruebas bioquímicas tradicionales y/o por sistemas miniaturizados tales como API o MicroID y mediante pruebas serológicas.

Aislamiento de E. coli.

1. Con un asa, hacer un aislamiento a partir de caldo lactosado, a agar MacConkey. Incubar a 35ºC por 24 horas.

2. Las colonias de coliformes en agar MacConkey son de color rojo ladrillo, eventualmente rodeadas de zonas de bilis precipitada.

3. Si no hay colonias típicas, la muestra cumple los requisitos en cuanto a ausencia de coliformes.

4. Si hay colonias típicas, transplante una de estas colonias a agar eosina-azul de metileno-lactosa, según Levine. Incubar a 35ºC por 24-48 horas. Las colonias de E. coli en este medio, se caracterizan por dar color negro azulado al trasluz ybrillo metálico dorado verdoso a la luz incidente.

5. Transferir las colonias típicas del agar eosina-azul de metileno-lactosa (agar Levine), a agar nutritivo inclinado y a agar TSI. Incubar a 35ºC por 24 horas.

6. Los cultivos típicos de E. coli en agar TSI presentan el bisel amarillo, sin oscurecimiento y con formación de gas.

7. Hacer una coloración de Gram: E. coli es un bacilo Gram negativo no esporulado.

8. Confirmar la presencia de E. coli por medio de pruebas bioquímicas adicionales como por ejemplo el Test del IMViC, o utilizando sistemas miniaturizados tales como API o MicroID.

Investigación de Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosa.

MATERIALES

Pipetas de 10 mL

Propipetas

Placas estériles

Caldo Soya Caseína (90 mL)

Agar Vogel-Johnson (o Baird Parker o manitol sal)

Agar nutritivo inclinado

Plasma EDTA (para coagulasa)

Caldo cerebro corazón

Agar cetrimide

Papel de filtro Reactivo N,N-dimetil-p-fenilen diamonio dicloruro

Asa y filamento

Mechero

Equipo para coloración de Gram

Estufa

PROCEDIMIENTO

Transferir con una pipeta estéril, 10 mL de la muestra a un balón que contiene 90mL de caldo soya caseína. Incubar a 30 - 35ºC por 24 - 48 horas.

Aislamiento de Staphylococcus aureus.

1. Agitar la mezcla incubada y mediante un asa hacer aislamiento a agar Vogel-Johnson (o agar Baird-Parker o agar manitol sal). Incubar a 35ºC por 24-48horas.

2. Las colonias típicas de Staphylococcus aureus en agar Vogel-Johnson o en agar Baird-Parker, son pequeñas, negras, rodeadas de una zona amarilla.

3. Si no hay colonias típicas, la muestra cumple el requisito en cuanto a ausencia de Staphylococcus aureus.

4. Si hay colonias típicas, con ayuda de un filamento, transferir un número representativo de las colonias sospechosas a tubos de agar nutritivo inclinado. Incubar a 35ºC por 24 horas.

5. A partir de los tubos de agar nutritivo, hacer coloración de Gram: el S. aureus es un coco Gram positivo. Transplantar a tubos con caldo cerebro corazón. Incubar a 35ºC por 24 horas.

6. Efectuar la prueba de coagulasa de la siguiente forma: En un tubo de Wassermann colocar 0,5 mL de Plasma EDTA (para coagulasa) reconstituido; añadir 2gotas (0,1 mL) del cultivo de 24 horas del microorganismo desarrollado en caldo cerebro corazón. Incubar en baño de agua a 37ºC, durante 3 horas. Examinar al cabo de este tiempo y luego periódicamente durante 24 horas, para comprobar la formación de coágulos; cualquier grado de coagulación, por pequeño que sea , se considera positivo.

Si no se observa coagulación, la muestra cumple el requisito en cuanto a ausencia de Staphylococcus aureus.

7. Confirmar la presencia de S. aureus por medio de pruebas bioquímicas.

Aislamiento de Pseudomonas aeruginosa.

1. Mediante un asa hacer aislamiento del caldo soya caseína a agar cetrimide. Incubar a 35ºC por 24 horas.

2. Las colonias típicas de Pseudomonas aeruginosa en agar cetrimide son pequeñas, generalmente de color verdoso, con fluorescencia verdosa a la luz ultra-violeta.

3. Si no hay colonias típicas, la muestra cumple el requisito en cuanto a ausencia de P. aeruginosa.

4. Si hay colonias típicas, transferir a agar nutritivo inclinado. Incubar a 35ºC por 24 horas.

5. A partir del agar nutritivo hacer una coloración de Gram: la P. aeruginosa es un bacilo Gram negativo no esporulado.

6. Efectuar la prueba de oxidasa: En una placa de Petri colocar un disco de papel de filtro. Impregnar con el reactivo N,N-dimetil-p-fenilen diamonio dicloruro y dejarlo secar en la estufa.

Con una pipeta Pasteur estéril con la punta cerrada, transferir una pequeña cantidad del cultivo del tubo de agar inclinado, al papel de filtro.

El desarrollo de un color rosado, casi púrpura, se considera una prueba de oxidasa positiva.

7. Si esta última es negativa, la muestra cumple el requisito en cuanto a ausencia de P. aeruginosa.

8. Si la prueba de oxidasa es positiva, la presencia de P. aeruginosa debe confirmarse por pruebas bioquímicas adicionales.

La validez de los resultados de los ensayos descritos (determinación del tipo de microorganismo), dependerá de la demostración de que las muestras bajo ensayo no presentan de por sí, efectos inhibidores de la multiplicación de los microorganismos que pudieran estar presentes. Por consiguiente, para demostrar el efecto inhibidor de las muestras, se realiza un ensayo adicional, preliminar o simultáneo considerado como control positivo que consiste en inocular los caldos de enriquecimiento que se utilizan en las técnicas descritas anteriormente, con 1 mL de una dilución 10-3 de un cultivo de 24 horas de cada uno de los microorganismos en investigación, añadir la cantidad apropiada de muestra y proceder de la misma forma como se describió para el ensayo de la muestra sola.

RESULTADOS

Anotar los resultados:______________________________________________________________